醫(yī)用試劑管中保存液的配置及使用方法

  ①在醫(yī)用試劑管中制作保存液時，稱142.14gTris置于燒杯中，加入750mL蒸餾水，用磁力攪拌器攪拌溶解均勻，然后加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.6，并調(diào)節(jié)體積至1L以制備1mol/L Tris-HCL(pH7.6)。

  ②稱取186.0克二水合乙二胺四乙酸二鈉于燒杯中，加入750毫升蒸餾水，然后加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.6，并定容至1L，配制成0.5mol/L EDTA。

  ③稱取20.0g月桂酰肌氨酸于燒杯中，緩慢攪拌，用蒸餾水溶解(泡沫較多)，并定容至100mL，制成20%月桂酰肌氨酸溶液。

  ④將90毫升蒸餾水、10.6毫升1摩爾/升tris-HCl (pH 7.6)、4.2毫升0.5摩爾/升EDTA和100克氰基胍異硫酸鹽置于燒杯中。在50℃加熱并攪拌1小時，直到完全溶解。

  ⑤待上述溶液完全溶解后，加入21.1ml 20%月桂酰肌氨酸和2.12mL巰基乙醇，攪拌均勻，4℃保存(4℃放置時間較長會有結(jié)晶析出，但不影響使用效果，可在醫(yī)用試劑管中的保存液一次性使用前加熱融化)。

  PCR系統(tǒng)中樣品濃度與Ct值的線性關(guān)系為66.6μLN基因假病毒(初始濃度為1×108 copies/mL)，用試劑管提取RNA，然后用30μLDEPC水洗脫。加入體積為20μl的PC R反應(yīng)體系中加入9μL純化的R NA模板，根據(jù)換算，反應(yīng)體系中假病毒的終濃度為1×108 copies/mL(忽略核酸提取過程中的損失)。用10倍梯度稀釋n基因假病毒，使假病毒在PC R反應(yīng)體系中的濃度梯度為:1×107、1×106、1×105、1×104和1×103 copies/mL，每個梯度平行制成三組。反應(yīng)體系為20μl: 5μl快速病毒1步主混合液，0。4μL上游和下游引物和探針，4.8μL DEPC水和9μL模板。擴(kuò)增程序:25℃2分鐘；50℃15分鐘；95℃2分鐘；90℃ 15秒，60℃ 45秒，45個循環(huán)，在60℃采集熒光信號。